Sumber Aneka Karya Abadi - Your trusted partner for laboratory instrument

Bagaimana cara mengoptimalisasi inkubasi media kultur? Tantangan dalam menginkubasi media kultur yaitu dapat terjadinya kontaminasi, suhu inkubasi yang tidak stabil ataupun kebutuhan nutrisi yang tidak memenuhi, pH media yang tidak sesuai ataupun faktor lainnya. Oleh karena itu, dalam mengoptimalkan inkubasi media kultur dapat dilakukan dengan mempertahankan keadaan steril baik itu selama proses pembuatan media ataupun selama inkubasi berlangsung, menyediakan kebutuhan nutrient yang sesuai dengan kebutuhan populasi kultur, menjaga pH media yang sesuai, dan menjaga suhu tetap konstan selama inkubasi dilakukan. Suhu konstan dan keadaan inkubasi yang optimal sebaiknya dilakukan diinkubasi di dalam inkubator yang sesuai dengan kebutuhan inkubasi media kultur.

Tujuan diinkubasinya suatu media kultur adalah untuk menumbuhkan suatu populasi mikroba untuk diamati. Adapun pertumbuhan populasi bakteri ini memiliki empat fase pertumbuhan yaitu fase lag atau adaptasi, fase log atau pertumbuhan eksponensial, fase stationer dan fase kematian.

1. Fase lag atau adaptasi

Fase lag atau fase adaptasi adalah fase yang dialami saat mikroba dipindahkan ke dalam suatu media, fase ini merupakan fase penyesuaian mikroba dengan kondisi lingkungan barunya. Lamanya fase adaptasi dapat dipengaruhi oleh beberapa faktor, diantaranya:

1. Media dan lingkungan pertumbuhan. Apabila media dan lingkungan pertumbuhan sama seperti sebelumnya, mungkin mikroba tidak memerlukan waktu adaptasi. Tetapi jika nutrient yang tersedia dan kondisi lingkungan yang baru berbeda dengan sebelumnya atau terbatas, diperlukan waktu penyesuaian untuk mensintesa enzim-enzim.
2. Jumlah inokulum. Jumlah awal sel yang semakin tinggi akan mempercepat fase adaptasi.

2. Fase log atau pertumbuhan eksponensial

Pada fase ini mikroba membelah dengan cepat dan konstan mengikuti kurva logaritmik. Hal ini sangat dipengaruhi oleh media tempat tumbuhnya seperti pH dan kandungan nutrient, juga kondisi lingkungan termasuk suhu dan kelembaban udara. Pada fase ini mikroba membutuhkan energi lebih banyak daripada fase lainnya. Pada fase ini kultur paling sensitive terhadap lingkungan. Akhir fase log, kecepatan pertumbuhan populasi akan menurun dikarenakan nutrient di dalam medium sudah berkurang dan adanya hasil metabolisme yang mungkin beracun atau dapat menghambat pertumbuhan mikroba.

3. Fase stationer

Pada fase ini jumlah populasi sel tetap karena jumlah sel yang tumbuh sama dengan jumlah sel yang mati. Ukuran sel pada fase ini menjadi lebih kecil karena sel tetap membelah meskipun zat-zat nutrisi sudah habis. Karena kekurangan zat nutrisi, sel kemungkinan mempunyai komposisi yang berbeda dengan sel yang tumbuh pada fase logaritmik. Pada fase ini sel-sel lebih tahan terhadap keadaan ekstrim seperti panas, dingin, radiasi, dan bahan-bahan kimia.

4. Fase kematian

Pada fase ini, sebagian populasi mikroba mulai mengalami kematian karena beberapa sebab yaitu:

1. Nutrient di dalam media sudah habis
2. Energi cadangan di dalam sel sudah habis

Laju kematian bergantung pada kondisi nutrient, lingkungan, dan jenis mikroba.

Empat fase pertumbuhan mikroba yang telah dijabarkan diatas dirangkum dalam kurva pada Gambar 1 di bawah ini.

Gambar 1. Kurva Fase Pertumbuhan Mikroba

Fase pertumbuhan mikroba ini sangat dipengaruhi oleh berbagai faktor seperti media kultur dan nutrient, pH, suhu, tekanan osmotic, oksigen (O₂)

Faktor-faktor yang harus diperhatikan dalam menginkubasi media kultur

1. Media Kultur dan Nutrisi

Mikroorganisme harus dibiakkan di laboratorium pada media kultur yang mengandung nutrient yang berperan penting untuk pertumbuhan dan perkembangbiakannya. Media berfungsi untuk menumbuhkan bakteri, isolasi, memperbanyak jumlah, menguji sifat-sifat fisiologis dan perhitungan jumlah bakteri, dimana dalam proses pembuatannya harus disterilisasi dan menerapkan metode aseptis untuk menghindari kontaminasi pada media. Jenis nutrient yang digunakan tergantung dari jenis bakteri yang dibiakkan.

Untuk menciptakan keadaan lingkungan yang tepat secara sintetis sebagai pengganti keadaan alam, maka diperlukan persyaratan tertentu agar bakteri dapat tumbuh dan berkembang dengan baik dalam media, yaitu:

1. Media harus mengandung semua unsur hara yang diperlukan untuk pertumbuhan dan perkembangan bakteri
2. Media harus mempunyai tekanan osmosis, tegangan permukaan dan pH yang sesuai dengan kebutuhan bakteri
3. Media harus dalam keadaan steril, artinya sebelum ditanami bakteri yang dimaksud, media tidak ditumbuhi oleh mikroba yang lain.

Nutrient adalah bahan makanan yang dikonsumsi melalui proses degesti, absorbs, transportasi, penyimpanan, metabolisme dan pengeluaran zat-zat yang tidak digunakan untuk mempertahankan kehidupan, pertumbuhan, dan fungsi normal organ, serta menghasilkan energi. Nutrient terdiri dari karbohidrat, lemak, vitamin, mineral dan air.

2. Suhu

Pengaruh suhu terhadap pertumbuhan mikroba adalah mempengaruhi laju reaksi enzimatis dan kimia di dalam sel.  Semakin meningkat suhu, maka laju reaksi akan semakin cepat. Namun, pada taraf suhu tertentu, komponen sel akan mengalami kerusakan.  Suhu akan meningkatkan metabolisme sampai pada titik terjadinya denaturasi.  Ketika mencapai titik tersebut, fungsi sel akan menurun sampai ke titik nol.  Berdasarkan  hal tersebut, ada tiga tingkatan suhu yang memengaruhi mikroorganisme.  Suhu minimum adalah batas terendah bagi suatu mikroba masih dapat hidup, suhu optimum adalah suhu optimal bagi suatu mikroba untuk melakukan pertumbuhan, dan suhu maksimum adalah batas tertinggi bagi suatu mikroba untuk dapat hidup.  

Berdasarkan bentuk adaptasi terhadap suhu, mikroba diklasifikasikan ke dalam empat, yaitu:

1. Psikrofilik adalah mikroba yang menyukai kondisi dingin.
2. Mesofilik adalah mikroba yang menyukai temperatur sedang. Contoh bakteri mesofilik adalah Clostridium botulinum.
3. Termofilik adalah mikroba yang menyukai kondisi panas. Contoh bakteri termofilik adalah Clostridium nigridicans dan Bacillus stearothermophilus.
4. Hipertermofilik adalah mikroba yang menyukai kondisi suhu sangat panas.

Gambar 2. Grafik Pengaruh Suhu terhadap pertumbuhan mikroba

Picture created by www.generasibiologi.com

3. pH

Pengaruh ph terhadap pertumbuhan mikroba berkaitan dengan kondisi asam atau basanya lingkungan suatu mikroba. Jika pH lebih rendah dari 7 (pH netral), berarti kondisi berada dalam keadaan asam. Sementara itu, nilai pH di atas 7 menunjukkan bahwa kondisi berada dalam keadaam basa (alkifilik). Jika dilihat dari pH, umumnya bakteri dapat tumbuh dengan baik pada pH netral (neutrofilik), yaitu 6,5 sampai 7,5.  Namun, ada juga mikroba yang tahan pada kondisi pH rendah atau asam (asidofilik) dan mikroba yang tahan pada kondisi pH tinggi atau basa (alkalifilik).

Gambar 3. Grafik pengaruh pH terhadap pertumbuhan mikroba

Picture created by www.generasibiologi.com

4. Tekanan osmotik

Faktor tekanan osmotik berkaitan dengan seberapa tinggi konsentrasi zat terlarut, seperti garam, gula, dan substansi lain, berada dalam suatu zat pelarut (air). Pengaruh tekanan osmotik terhadap pertumbuhan mikroba adalah substansi yang terlarut mempunyai afinitas kepada air, membuat air berasosiasi dengannya sehingga lebih sedikit tersedia untuk organisme.  Jika konsentrasi larutan pada suatu lingkungan melebihi yang berada dalam sitoplasma, air di dalam sel akan keluar.  Hal tersebut akan memberikan ancaman yang serius karena sel bisa dehidrasi sehingga sel tidak dapat tumbuh. Ketersediaan air diekspresikan dalam bentuk aktivitas air atau diberi simbol aw. Berdasarkan bentuk adaptasi terhadap tekanan osmotik, mikroba dikelompokkan menjadi halophile, osmophile, dan xerophile.

Halofilik adalah mikroba yang mampu tumbuh pada kondisi lingkungan yang konsentrasi garamnya sangat tinggi, disebut juga sebagai extreme halophile. Terdapat pula mikroba yang termasuk halotolerant, yaitu jenis yang mampu hidup ketika terjadi pengurangan kadar air, namun mikroba tersebut dapat tumbuh lebih baik apabila tidak terjadi pengurangan kadar aiar atau penambahan zat terlarut.  Sementara itu, osmophile adalah organisme yang mampu hidup pada kondisi gula yang tinggi dalam sebuah larutan.  Xerophile adalah organisme yang mampu hidup pada kondisi lingkungan kering (keringnya karena kekurangan air bukan karena tingginya konsentrasi zat terlarut). 

5. Oksigen (O₂)

Sementara itu, oksigen berperan penting bagi mikroorganisme dalam hal respirasi sel.  Namun, tidak semua mikroorganisme membutuhkan oksigen ketika melakukan respirasi sel. Berdasarkan kebutuhan mikroorganisme terhadap oksigen, maka mikroorganisme dikelompokkan menjadi aerob obligat, aerob fakultatif, mikroaerophile, aerotolerant, dan anaerob obligat.           

Aerob obligat adalah jenis mikroba yang membutuhkan O₂ dan tipe metabolismenya adalah respirasi aerobik.  Aerob fakultatif adalah jenis mikroba yang tidak membutuhkan O₂, namun tumbuh dengan baik jika tersedia O₂. Tipe metabolisme pada mikroba aerob fakultatif ialah respirasi aerobik, fermentasi, dan respirasi anaerobik.  Mikroaerofil adalah jenis mikroba yang membutuhkan O₂ dalam jumlah yang sedikit, tipe metabolismenya adalah respirasi aerobik. Aerotolerant adalah jenis mikroba yang tidak membutuhkan O₂ dan mengalami pertumbuhan yang lambat jika tersedia O₂. Tipe metabolisme jenis aerotolerant adalah fermentasi.  Anaerob obligat adalah jenis mikroba yang akan letal atau rusak jika tersedia O₂ dan tipe metabolismenya adalah fermentasi atau respirasi anaerobik.

6. Kontaminan

Faktor kontaminan dapat memengaruhi proses inkubasi suatu kultur mikroorganisme, misalnya adalah peristiwa sinergisme mikroba atau antagonisme mikroba.  Sinergisme mikroba adalah peristiwa pada dua atau lebih mikroba yang secara bersama-sama memproduksi substansi yang tak satupun dapat memproduksinya secara terpisah. Antagonisme mikroba adalah peristiwa salah satu organisme pertumbuhannya terhambat dan yang lainnya tidak terhambat (peristiwa tersebut disebut juga antibiose).  Hal tersebut karena organisme inhibitor dapat memproduksi substansi yang menghambat atau membunuh satu atau lebih mikroorganisme. Zat yang dapat menghambat atau mematikan mikroorganisme yang lain disebut zat antibiotik.

Seperti yang telah dijabarkan sebelumnya bahwa banyak faktor yang dapat memengaruhi pertumbuhan populasi mikroorganisme, untuk itu dalam memenuhi lingkungan yang tepat untuk inkubasi, media kultur perlu diinkubasi di dalam inkubator yang disesuaikan dengan kondisi lingkungannya. Oleh karena itu, kita perlu memilih inkubator yang tepat, guna mengoptimalkan proses inkubasi suatu media kultur.

Tips dalam memilih inkubator untuk mengoptimalkan inkubasi suatu media kultur adalah sebagai berikut:

1. Pilih kapasitas inkubator yang sesuai dengan kebutuhan atau jumlah sampel yang akan diinkubasi dalam satu periode inkubasi
2. Pilih inkubator cakupan parameter yang dibutuhkan untuk diatur pada inkubator seperti suhu, kelembaban, dan gas.
3. Pilih range parameter di inkubator yang sesuai dengan media yang dikultur seperti range suhu.
4. Pilih inkubator yang memiliki system pemanasan pada semua bagian sisi chamber.
5. Pilih inkubator yang memiliki system sirkulasi suhu yang sesuai dengan kebutuhan kultur seperti system sirkulasi natural atau dengan menggunakan fan.
6. Pilih inkubator yang memiliki inner door berbahan glass guna mencegah terjadinya kontaminasi dan memudahkan analis dalam melakukan pemantauan atau pengecekan selama kultur di inkubasi.
7. Pilih inkubator yang telah dilengkapi dengan teknologi canggih yang memudahkan analis untuk menggunakannya, seperti digital control dengan TFT-colour display
8. Pilih inkubator yang terbuat dari bahan stainless steel yang berkualitas sehingga memudahkan untuk dibersihkan dan anti-korosif
9. Pilih inkubator dengan setting accuracy temperature terkecil, misalnya 0,1 °C.
10. Pilih inkubator yang dapat dipindahkan data log parameter melalui ethernet ataupun USB.
11. Pilih inkubator yang telah dilengkapi dengan program menu kalibrasi.

Adapun contoh inkubator yang dapat mengoptimalkan inkubasi suatu media kultur ditampilkan pada gambar di bawah ini.

Gambar 4. Inkubator

Selain memilih inkubator yang tepat guna mengoptimalkan inkubasi suatu media kultur, kita juga perlu memerhatikan hal-hal lainnya seperti:

1. Meletakan posisi inkubator yang sesuai dengan anjuran pabrikan.
2. Menjaga suhu inkubasi tetap konstan dan stabil
3. Pemilihan media yang tepat.
4. Media yang digunakan sebaiknya harus disterilkan sebelum digunakan, hal ini guna mencegah kontaminasi yang dapat menyebabkan kerusakan pada media serta mengganggu pertumbuhan mikroba yang dikultur.
5. Posisi cawan petri harus terbalik. Hal ini dilakukan agar uap air yang terbentuk selama inkubasi tidak jatuh mengenai permukaan media sehingga tidak memengaruhi hasil pengamatan.
6. Meletakan petri atau wadah media ke dalam inkubator sesuai dengan anjuran pabrikan sehingga sirkulasi suhu dalam chamber inkubator dapat tersirkulasi dan merata ke seluruh bagian chamber.
7. Pembersihan rutin wajib untuk dilakukan setelah dilakukan inkubasi guna mencegah terjadinya kontaminasi pada kultur selanjutnya dan meminimalisir terbentuknya korosi pada alat sehingga dapat menyebabkan kerusakan pada alat. Apabila inkubator yang digunakan adalah inkubator yang terbuat dari bahan stainless steel, maka sebaiknya pembersihan rutin dilakukan dengan menggunakan pembersih khusus untuk bahan stainless steel.
8. Jangan menggunakan pelarut kimia untuk membersihkan bagian-bagian inkubator
9. Bersihkan bagian yang kaca pada inkubator dengan menggunakan pembersih khusus kaca.
10. Kalibrasi inkubator sebaiknya dilakukan secara rutin dengan periode minimal satu tahun sekali.

 

Referensi :

Madigan, M. T., J. M. Martinko, D. A. Stahl, D. P. Clark. 2011. Brock biology of microorganisms, 13th ed.

Tortora, G. J., B. R. Funke & C. L. Case. 2010. Microbiology: An introduction, 10th ed

Tamam, M H Badrut. Faktor yang mempengaruhi pertumbuhan. mikroorganisme. https://generasibiologi.com/2016/11/faktor-mempengaruhi-pertumbuhan-mikroba-bakteri.html. diakses pada 10 November 2022 Pukul 15:03 wib.

Wahyuni & Indrie Ramadhani. 2020. Mikrobiologi dan Parasitologi. Penerbit CV Pena Persada