Sumber Aneka Karya Abadi - Your trusted partner for laboratory instrument

Saat ini produk makanan beku (frozen food) sangat digemari oleh masyarakat, dan tidak sedikit pula  produsen-produsen baru yang memproduksi makanan beku. Namun tahukah Anda bahwa sebelum produk frozen food mencapai market atau pasar bahkan masyarakat, produsen wajib untuk menjamin kualitas produk frozen food yang diproduksi. Tahukah Anda parameter kualitas apa saja yang perlu dijaga pada produk frozen food? Adapun parameter yang wajib diuji adalah uji sensori, penentuan kadar air, suhu, cemaran mikroba dan cemaran logam. Walaupun produk frozen food adalah produk yang mengutamakan stabilitas suhu dinginnya/bekunya, namun hal ini tidak menutup kemungkinan bahwa  penurunan kualitas bahkan kerusakan pada mutu produk dapat terjadi. 

Salah satu faktor penyebab penurunan kualitas bahkan terjadinya kerusakan pada produk frozen food adalah adanya cemaran mikroba yang juga merupakan salah satu parameter uji dalam menentukan kualitas suatu produk frozen food. Cemaran mikroba pada makanan beku dapat terjadi karena beberapa faktor seperti proses pengolahan yang tidak steril, kontaminasi saat proses pengemasan, proses penyimpanan yang tidak sesuai dan lainnya. Dengan demikian, uji cemaran mikroba pada produk frozen food sangat penting untuk dilakukan. Uji ini juga direkomendasikan oleh Standar Nasional Indonesia (SNI) dan Association of Official Analytical Chemist (AOAC) Official Method 966.23.

Cara Uji Cemaran Mikroba

Terdapat tiga uji cemaran mikroba yang harus dilakukan dalam mengontrol kualitas produk frozen food, yaitu penentuan Angka Lempeng Total (ALT) atau Total Plate Count (TPC), Eschericia coli, dan Salmonella.

1. Angka Lempeng Total (ALT) atau Total Plate Count (TPC)

Uji Angka Lempeng Total (ALT) atau Total Plate Count (TPC) dilakukan untuk mengkonfirmasi keberadaan dan jumlah mikroba yang terdapat dalam suatu produk dengan cara menghitung koloni bakteri yang tumbuh pada media agar. Adapun media yang dibutuhkan pada uji ALT atau TPC adalah Plate Count Agar (PCA) dan Buffered Pepton Water (BPW) 0.1%.

Persiapan sampel dengan pengenceran 10^-1 dilakukan dengan menambahkan larutan Buffered Pepton Water (BPW) 0,1% yang berisi sampel dan dihomogenkan, kemudian dilanjutkan dengan pembuatan pengenceran 10^-2, 10^-3, 10^-4, 10^-5 dan seterusnya sesuai kebutuhan dengan menambahkan larutan BPW 0,1% pada larutan pengenceran 10^-1. Selanjutnya suspensi dari setiap pengenceran dimasukkan kedalam cawan petri secara duplo dan ditambahkan Plate Count Agar (PCA) yang telah didinginkan hingga suhu 45⁰C pada masing-masing cawan petri dan dicampur dengan cara melakukan pemutaran cawan dengan arah ke depan dan ke belakang atau membentuk angka delapan dan didiamkan hingga menjadi padat. Setelah itu diinkubasi dalam inkubator pada suhu 34⁰C – 36⁰C selama 24 jam atau 48 jam dengan posisi cawan terbalik.

Berikutnya setelah diinkubasi selama 24 jam atau 48 jam pada inkubator dilakukan perhitungan jumlah koloni pada setiap seri pengenceran dengan menggunakan colony counter.

2. Pengujian Most Probable Number (MPN) Eschericia coli

Pengujian Most Probable Number (MPN) Eschericia coli dilakukan dengan beberapa tahapan uji yaitu uji pendugaan, uji peneguhan dan isolasi-identifikasi melalui uji biokimia indole, methyl Red, Voges-Proskauer dan Citrate (IMViC).

a) Uji pendugaan dilakukan dengan membuat sampel dengan pengenceran 10^-1, 10^-2 dan 10^-3 dengan menggunakan BPW 0,1% kemudian dimasukkan sejumlah setiap hasil pengenceran ke dalam 3 seri tabung Lauryl Sulfate Tryptose Broth (LSTB) yang berisi tabung Durham dan diinkubasi di dalam inkubator pada suhu 35⁰C selama 24 jam sampai dengan 48 jam kemudian analis dapat melakukan pengamatan dengan memerhatikan adanya gas yang terbentuk di dalam tabung Durham. Hasil uji dinyatakan positif apabila adanya atau terbentuknya gas pada kultur. Selanjutnya dilakukan uji konfirmasi dengan memindahkan kultur yang positif dengan ditandai adanya gas ke dalam tabung ECB yang berisi tabung Durham dan diinkubasikan dalam inkubator pada suhu 45,5⁰C selama 24 jam dan hasil uji dinyatakan positif apabila adanya atau terbentuknya gas pada kultur. Kemudian nilai MPN berdasarkan jumlah tabung Escherichia Coli Broth (ECB) yang positif dengan mengacu pada tabel nilai MPN pada SNI.

b) Setelah itu dilakukan uji isolasi-identifikasi dengan menggunakan media Levine Eosin Methylene Blue Agar (L-EMBA) atau Violet Red Bile Agar (VRBA) dan diinkubasi pada suhu 35⁰C selama 18 jam sampai dengan 24 jam. Hasil uji ini ditunjukkan dengan koloni yang diduga E. coli berdiameter 2 mm sampai dengan 3 mm, berwarna hitam atau gelap pada bagian pusat koloni, dengan atau tanpa metalik kehijauan yang mengkilat pada media L-EMBA.

c) Kemudian dilanjutkan dengan uji Biokima dan uji IMViC, yaitu dengan cara koloni positif E. coli pada media L-EMBA dipindahkan ke media PCA miring dan diinkubasikan pada temperature 35⁰C selama 18 jam sampai dengan 24 jam. Dan dilanjutkan dengan uji Biokimia yang meliputi uji indole, uji Voges-Proskauer (VP), dan uji Metyl Red (MR) dan uji citrate.

(1) Uji produksi indole : Uji produksi indole dilakukan dengan cara koloni pada tabung media PCA diinokulasikan pada media Tryptose Broth (TB) dan diinkubasikan pada suhu 35⁰C selama 24 jam. Setelah diinkubasi, kultur pada tabung TB ditambahkan sejumlah reagen Kovac dan diamati hasilnya. Hasil reaksi positif ditunjukkan dengan adanya bentuk cincin merah pada lapisan atas media, sedangkan hasil reaksi negatif ditunjukkan dengan terbentuknya cincin kuning.

(2) Uji Voges-Proskauer (VP) : Uji Voges-Proskauer (VP) dilakukan dengan menggunakan media MR-VP dan diinkubasikan dalam inkubator pada suhu 35⁰C selama 48 jam, kemudian dipindahkan ke dalam tabung reaksi dan ditambahkan larutan α-naphthol juga Kalium Hidroksida (KOH) 40% dan dihomogenkan dan diamati reaksinya. Hasil reaksi positif ditunjukkan dengan adanya warna merah muda eosin dalam waktu 2 jam.

(3) Uji Methyl Red (MR) : Uji Methyl Red dilakukan dengan menggunakan media MR-VP dan diinkubasikan dalam inkubator pada suhu 35⁰C selama 48 jam. Setelah diinkubasi, kultur ditambahkan beberapa tetes indikator MR dan dilakukan pengamatan terhadap hasil uji. Hasil uji positif ditunjukkan dengan adanya warna merah dan apabila hasil uji adalah negatif, hasil kultur memperlihatkan warna kuning.

(4) Uji citrate : Tahap Uji E. coli yang terakhir yaitu uji citrate dengan menggunakan media Koser Citrate Broth (KCB) dan diinkubasikan pada suhu 35⁰C selama 96 jam. Setelah dilakukan inkubasi, kultur diamati dengan interpretasi positif apabila kultur menunjukkan terbentuknya kekeruhan pada media. 

3. ​​Salmonella

Uji pertumbuhan Salmonella dilakukan pada media selektif dengan pra-pengayaan (pre-enrichment), dan pengayaan (enrichment) yang dilanjutkan dengan uji biokimia dan uji serologi. Pra-pengayaan dilakukan dengan cara menimbang sejumlah sampel dengan menggunakan timbangan analitik dan dimasukkan kedalam erlenmeyer atau wadah yang telah disterilkan dengan menggunakan oven atau autoklaf dan diinkubasikan dalam inkubator pada suhu 35⁰C selama 24 jam. Selanjutnya dilakukan pengayaan dimasukkan kedalam media Tetra Tionate Broth (TTB) dan media Rappapport Vassiliadis (RV) dan diinkubasikan dengan menggunakan inkubator. Setelah diinkubasi, koloni yang telah diinkubasi pada media-media pengayaan diambil dan diinokulasikan pada media Hektoen Enteric (HE) Agar, Xylose Lysine Deoxycholate (XLD) Agar dan Bismuth Sulfite Agar (BSA) dan diinkubasikan lagi dalam inkubator pada suhu 35⁰C selama 24 jam. Kemudian koloni yang tumbuh diamati dengan melihat warna koloni yang terinterpetrasi pada media. Pada media HE, koloni Salmonella menunjukkan warna hijau kebiruan dengan atau tanpa titik hitam. Sedangkan pada media XLD, koloni Salmonella memperlihatkan warna merah muda dengan atau tanpa titik mengkilat atau terlihat hampir seluruh koloni Salmonella berwarna hitam. Selain itu, pada media Bismuth Sulfite Agar (BSA) koloni Salmonella terlihat keabu-abuan atau kehitaman, kadang metalik, juga media disekitaran koloni berwarna coklat dan semakin lama waktu inkubasi di dalam inkubator akan berubah menjadi warna hitam. Kemudian dilakukan identifikasi dengan menginokulasikan koloni yang diduga dari ketiga media diatas kedalam media Triple Sugar Iron Agar (TSIA) dan Lysine Iron Agar (LIA) dan diinkubasikan di dalam inkubator pada suhu 35C selama 24 jam dan dilihat hasil reaksinya.

Berikutnya dilakukan uji biokimia yaitu dengan menguji urease, uji indole, uji Voges-Proskauer (VP), uji Methyl Red (MR), uji citrate, uji Lysine Decarboxylase Broth (LDB), uji Kalium Cyanida (KCN), uji gula yang meliputi phenol red dulcitol broth atau purple broth base dengan 0,5% dulcitol, uji malonate broth, uji phenol red lactose broth, dan uji phenol red sucrose broth. Setiap pengujian dilakukan dengan menginkubasi sampel di dalam inkubator pada suhu 35⁰C selama 24 jam. Kemudian dilakukan identifikasi dengan menginokulasikan koloni yang diduga dari ketiga media

Setelah itu, dilakukan pengujian serologi yang meliputi uji polyvalent somatic (O) dan uji polyvalent flagelar (H) yang mana sampel koloni dari TSIA atau LIA hasil uji urease diinokulasikan ke dalam media Brain Heart Infusion Broth (BHIB) dan diinkubasikan dalam inkubator pada suhu 35⁰C selama 4 jam sampai dengan 6 jam atau diinokulasikan ke dalam media Trypticase Soy Tryptose Broth (TSTB) diinkubasikan dalam inkubator pada suhu 35⁰C selama 24 jam. Setelah diinkubasi kemudian ditambahkan sejumlah larutan garam fisiologis berformalin (formalinized physiological saline) ke dalam media kultur dan ditambahkan antigen, kemudian dipindahkan ke dalam tabung serologi dan diinkubasikan di dalam waterbath pada suhu 48⁰C sampai dengan 50⁰C dan dilakukan pengamatan setiap 15 menit bilamana terjadi penggumpalan selama 1 jam. Hasil uji menunjukkan positif Salmonella apabila terjadi penggumpalan.

Selain cara pengujian yang sesuai dengan prosedurnya, ada beberapa hal yang perlu diperhatikan analis dalam melakukan uji cemaran mikroba yaitu:

1. Meminimalisir kesalahan formulasi. Seperti kesalahan penimbangan sampel dan bahan. Sebaiknya analis menggunakan timbangan analitik yang nilai akurasinya memiliki penyimpangan terkecil, seperti pada Gambar 1.

​Gambar 1. Timbangan Analitik

2. Meminimalisir kesalahan interpertasi hasil yaitu dengan cara meminamilisir kesalahan dalam pembuatan media, seperti media gagal memadat, nilai pH media yang tidak sesuai atau pengukuran nilai pH pada suhu yang salah, warna media abnormal, media yang terkontaminasi, pemakaian bahan media yang expired sehingga dapat mengganggu kondisi kultur, dan lain sebagainya.

3. Menggunakan inkubator dan waterbath yang thermostable dengan range suhu yang memiliki rentang yang mencapai 35⁰C sampai dengan 50⁰C. Selain itu inkubator dan waterbath yang digunakan juga memiliki rentang waktu inkubasi yang lama yaitu bisa mencapai 4 jam sampai dengan 96 jam, seperti pada Gambar 2 dan Gambar 3. Hal ini guna memudahkan analis agar tidak membutuhkan banyak unit inkubator dan waterbath yang digunakan dalam semua tahapan uji cemaran mikroba.

Gambar 2. Inkubator

Gambar 3. Waterbath

4. Penggunaan air yang sesuai untuk pembuatan media sehingga meminimalisir kontaminasi dari air yang digunakan.

5. Menggunakan teknik aseptik yang tepat sehingga kultur uji tidak mudah terkontaminasi.

6. Menggunakan oven atau autoklaf yang thermostable, seperti pada gambar 4 dan Gambar 5 untuk sterilisasi glassware.

Gambar 4. Oven

Gambar 5. Autoklaf

7. Sterilisasi ruangan pengujian yang tidak terkontrol sehingga dapat mengkontaminasi kultur.

​Referensi:

AOAC official method 966.23 Microbiological Method

Standar Nasional Indonesia