Sumber Aneka Karya Abadi - Your trusted partner for laboratory instrument

Uji mikrobiologi merupakan salah satu parameter yang penting untuk diuji dalam menentukan kualitas suatu bahan pakan dan pakan buatan. Tahukah Anda uji mikrobiologi apa saja yang wajib dilakukan pada pengujian kualitas bahan pakan dan pakan buatan? Uji mikrobiologi yang perlu dilakukan dalam bahan pakan dan pakan buatan yaitu uji Salmonella, uji Angka lempeng Total (ALT) dan uji kapang dan umumnya syarat baku mutu oleh Standar Nasional Indonesia (SNI) uji mikrobiologi pada bahan pakan dan pakan buatan yaitu uji Salmonella harus menunjukkan hasil negatif (-), sedangkan uji ALT adalah maksimal 5x10³ kol/g (koloni/gram) sampai 7,5x10³ kol/g dan uji kapang adalah maksimal 50 kol/g. Uji Mikrobiologi pada bahan pakan dan pakan buatan dilakukan guna menghasilkan produk pakan yang berkualitas dan higienis. Pengujian mikrobiologi dapat merujuk pada beberapa standar acuan yaitu SNI, International Organization of Standardization (ISO) 7218 Tahun 2007, dan AOAC official Methods 2005 Chapter 4 Animal Feed, dalam standar-standar ini juga telah dijabarkan beberapa spesifikasi alat yang perlu digunakan dalam pengujian mikrobiologi pada bahan pakan dan pakan buatan, seperti autoklaf, oven, inkubator, waterbath, colony counter dan mikroskop.

 

Apa itu Bahan Pakan dan Pakan Buatan?

Bahan pakan adalah bahan hasil pertanian (bahan nabati), perikanan dan peternakan (bahan hewani), atau vitamin dan mineral, serta bahan penunjang lainnya yang layak dipergunakan sebagai pakan, baik yang telah diolah maupun yang belum diolah, yang dipergunakan untuk melengkapi komposisi pakan.

Sedangkan pakan buatan yaitu berupa hasil campuran dari beberapa bahan baku dan bahan imbuhan pakan, sehingga mempunyai nilai gizi tertentu yang mampu mendukung terhadap pertumbuhan dan perkembangbiakan. Pakan ini dibuat melalui proses pencetakan, berbentuk butiran atau pellet, atau bentuk lainnya yang disesuaikan dengan ukuran bukaan mulut ternak dan sifat fisik pakan ini dapat mengapung, melayang, tenggelam atau lainnya.

 

Uji Mikrobiologi Pada pakan

1. Uji Angka lempeng Total (ALT)

Uji Angka Lempeng Total (ALT) pada bahan pakan dan pakan buatan dilakukan dengan cara mikroorganisme ditumbuhkan dengan metode agar tuang, diinkubasikan dalam kondisi aerob atau anaerob pada suhu dan waktu yang sesuai hingga tumbuh dan berkembang biak dengan membentuk koloni yang dapat dihitung.

Persiapan pengujian dilakukan dengan menyiapkan sejumlah sampel dan dimasukkan dalam wadah atau plastik steril dan ditambahkan larutan Butterfield’s Phosphate Buffered dan dihomogenkan, larutan ini merupakan larutan pengenceran 10^-1, selanjutnya dibuatkan larutan pengenceran 10^-2, 10^-3, 10^-4, 10^-5, dan seterusnya yang disesuaikan dengan kondisi atau kebutuhan sampel yang akan diuji.

Setelah itu dilakukan pengujian Angka Lempeng Total (ALT) aerob dan ALT anaerob. Uji ALT aerob dilakukan dengan cara sejumlah hasil pengenceran dipipet dan dimasukkan ke dalam cawan petri steril dan dilakukan secara duplo untuk setiap pengenceran. Kemudian ditambahkan media Plate Count Agar (PCA) dan dicampur dengan cara memutar cawan petri ke arah depan - ke belakang dan ke kiri - ke kanan. Kemudian cawan - cawan petri tersebut diinkubasikan dengan posisi terbalik di dalam inkubator pada suhu 35°C ± 1°C untuk bakteri mesofilik atau pada suhu 35°C ± 1°C untuk bakteri termofilik selama 48 jam ± 2 jam. Sedangkan untuk uji ALT anaerob dilakukan dengan cara menuangkan sejumlah media PCA atau media Nutrient Agar (NA) atau media Tryptic Soy Agar (TSA) ke dalam cawan petri steril dan disebarkan, kemudian dibiarkan mengeras dan pipet sejumlah sampel yang telah diencerkan ke setiap cawan petri untuk setiap pengenceran dan dilakukan secara duplo. Setelah itu ditambahkan sejumlah Thioglycolate agar dan dicampurkan dengan cara diputar secara hati - hati. Lalu cawan - cawan petri tersebut diatur di dalam anaerobic jar dengan posisi terbalik dan diletakkan di dalam inkubator pada suhu 35°C ± 1°C untuk bakteri mesofilik atau pada suhu 35°C ± 1°C untuk bakteri termofilik selama 48 jam ± 2 jam.

Setelah diinkubasi, dilakukan pembacaan dan perhitungan koloni dengan menggunakan colony counter dan dilakukan perhitungan dengan menggunakan rumus dan/atau berpatokan pada SNI 2332 Bagian 3 Tahun 2015.

2. Uji Salmonella

Pertumbuhan Salmonella pada media selektif dengan pra- pengayaan (pre-enrichment), dan pengayaan (enrichment) yang dilanjutkan dengan uji biokimia dan uji serologi.

Pengujian Salmonella spp. adalah sebagai berikut:

• Pra-pengayaan: Pra-pengayaan dilakukan dengan menambahkan larutan Lactose Broth (LB) dan diinkubasikan pada temperatur 35 ⁰C selama 24 jam ± 2 jam
• Pengayaan: Biakan pra-pengayaan dipindahkan ke dalam media Tetra Thionate Broth (TTB) dan Rappapport Vassiliadis (RV). Untuk pengayaan pada media TTB, diinkubasikan pada temperatur 35 °C ± 2 °C selama 24 jam ± 2 jam. Sedangkan pengayaan pada media RV, diinkubasikan pada temperatur 42 °C ± 0,2 °C selama 24 jam ± 2 jam.
• Isolasi dan identifikasi: setelah diinkubasikan, koloni Salmonella spp. diambil dan diinokulasikan pada media Hektoen Enteric Agar (HEA), Xylose Lysine Deoxycholate Agar (XLDA) dan Bismuth Sulfite Agar (BSA). Selanjutnya diinkubasikan pada temperatur 35 °C selama 24 jam ± 2 jam. Amati koloni Salmonella pada media HE terlihat berwarna hijau kebiruan dengan atau tanpa titik hitam (H2S). Pada media XLD koloni terlihat merah muda dengan atau tanpa titik mengkilat atau terlihat hampir seluruh koloni hitam. Untuk media BSA koloni terlihat keabu-abuan atau kehitaman, kadang metalik, media di sekitar koloni berwarna coklat dan semakin lama waktu inkubasi akan berubah menjadi hitam. Kemudian lakukan identifikasi dengan mengambil koloni yang diduga dari ketiga media tersebut. Inokulasikan ke Triple Sugar Iron Agar (TSIA) dan Lysine Iron Agar (LIA) dengan cara menusuk ke dasar media agar, selanjutnya digores pada media agar miring. Selanjutnya diinkubasikan pada temperatur 35 °C selama 24 jam ± 2 jam.
• Uji biokimia dilakukan dengan uji urease, uji indole, uji Voges-Proskauer (VP), uji Methyl Red (MR), uji citrate, uji Lysine Decarboxylase Broth (LDB), uji Kalium Cyanide (KCN), dan uji gula-gula; yang terdiri atas uji Phenol Red Dulcitol Broth atau Purple Broth Base dengan 0,5 % dulcitol, uji Malonate Broth, uji Phenol Red Lactose Broth, dan uji Phenol Red Sucrose Broth.
• Kemudian Uji serologis: uji serologis terdiri atas uji Polyvalent Somatic (O) dan uji Polyvalent Flagelar (H).

3. Uji Kapang

Kapang adalah mikroorganisme yang terdiri lebih dari satu sel berupa benang-benang halus yang disebut hifa, kumpulan hifa disebut miselium dan berkembangbiak dengan spora. Pengujian Kapang dilakukan dengan prinsip pertumbuhan kapang dihitung setelah sampel diinkubasikan dalam media agar pada suhu 25°C di dalam inkubator selama lima hari. Penentuan jumlah kapang dapat dilakukan dengan dua cara yaitu metode cawan agar tuang (pour plate) dan atau cawan agar sebar (spread plate).

Setelah diinkubasi, dilakukan pembacaan dan perhitungan koloni dengan menggunakan colony counter dan/atau berpatokan pada SNI 2332 Bagian 7 Tahun 2015.

 

Alat Uji Mikrobiologi

Sesuai dengan Good Laboratory Practice (GLP), semua peralatan dan peralatan pengujian harus dijaga kebersihannya dan dalam kondisi kerja yang baik. Sebelum digunakan, peralatan harus diverifikasi kesesuaiannya dengan tujuan yang dimaksudkan dan jika perlu kinerjanya dipantau selama penggunaan dengan cara dilakukan pemantauan dan dikalibrasi ke standar nasional yang diakui keabsahannya. Selain itu, peralatan harus diperiksa dan dipelihara secara teratur untuk memastikan keamanan dan kualitasnya untuk digunakan.

Alat-alat uji mikrobiologi yang umumnya dibutuhkan dan perlu diperhatikan dalam pengujian mikrobiologi adalah autoklaf, oven, waterbath, inkubator, mikroskop dan colony counter.

1. Autoklaf

Sterilisasi dapat dilakukan dengan 2 cara yaitu sterilisasi basah dan sterilisasi kering. Telah diketahui bahwa sterilisasi merupakan proses menghilangkan semua mikroorganisme (bakteri, virus, fungi dan parasit) termasuk endospora. Sterilisasi dengan menggunakan metode uap tekanan tinggi, dulunya secara konvensional dilakukan dengan menggunakan sterilisator uap non-elektrik yang membutuhkan bahan bakar minyak tanah atau lainnya sebagai sumber panas. Kemudian dalam perkembangannya, tersedia alat sterilisator uap tekanan tinggi elektrik yang sumber panasnya berasal dari energi listrik yang disebut dengan autoklaf (autoclave). Sterilisasi basah dilakukan dengan menggunakan autoklaf. Alat autoklaf yaitu alat yang digunakan dalam pengujian mikrobiologi untuk melakukan sterilisasi secara basah atau dengan sistem penguapan, yang mana biasanya digunakan untuk sterilisasi media ataupun glassware untuk pengujian. Dalam perkembangan teknologi hingga saat ini, autoklaf telah tersedia dalam dua jenis yaitu autoklaf manual dan autoklaf digital atau disebut juga dengan autoklaf otomatis.

Penggunaan autoklaf dapat beresiko terhadap user (pengguna) seperti bahaya fisik yang disebabkan oleh suhu tinggi, uap, tekanan dan benda tajam; bahaya biologis seperti infeksi dari bahan yang disterilisasi. Oleh karena itu, beberapa hal yang perlu diperhatikan untuk mencegah bahaya dari penggunaan autoklaf adalah sebagai berikut:

1. Air untuk sterilisasi dengan menggunakan autoklaf harus menggunakan air suling (aquades) dan tidak boleh menggunakan air keran (tap water).
2. Pastikan untuk mengisi aquades sebelum sterilisasi dilakukan. Jangan pernah melakukan sterilisasi tanpa mengisi aquades terlebih dahulu, hal ini dapat merusak elemen pemanas pada autoklaf.
3. Peletakan autoklaf diharapkan jauh dari bahan mudah terbakar.
4. Pastikan bahwa alat atau bahan yang disterilisasi diletakan tidak terlalu rapat di dalam autoklaf sehingga sirkulasi uap dapat optimal.
5. Pastikan bahwa penutup autoklaf telah tertutup rapat dan terkunci dengan benar sebelum digunakan.
6. Jangan mengeluarkan alat dan bahan yang disterilisasi sebelum suhu turun di bawah 80⁰C. dan tekanan mencapai 0 sebelum autoklaf dibuka.
7. Penggunaan sarung tangan tahan panas dianjurkan jika ingin menyentuh autoklaf saat digunakan atau sebelum menjadi dingin. Selain itu, pengambilan alat tajam yang disterilisasi dengan menggunakan forceps dan jangan menggunakan tangan secara langsung.
8. Selama siklus sterilisasi, penggunaan autoklaf untuk mensterilkan peralatan bersih (dan atau media biakan), tidak dilakukan secara bersamaan dengan dekontaminasi peralatan yang sudah digunakan (dan atau media biakan yang telah digunakan). Sebaiknya menggunakan autoklaf terpisah untuk kedua proses tersebut atau dilakukan secara bergantian pada autoklaf yang sama.

2. Oven

Alat oven dalam pengujian mikrobiologi digunakan untuk proses sterilisasi kering dan bisa juga digunakan untuk proses pengeringan. Sterilisasi dalam pengujian mikrobiologi penting untuk dilakukan guna memastikan alat-alat ataupun media yang akan digunakan selama pengujian tidak terkontaminasi sebelum digunakan sehingga tidak akan terjadinya kegagalan dalam pengujian mikrobiologi pada suatu sampel uji.

Oven yang digunakan dalam pengujian mikrobiologi khususnya untuk proses sterilisasi sebaiknya memiliki tombol power untuk menghidupkan dan/atau mematikan fungsi kipas, serta dapat dinaikan ataupun diturunkan kecepatannya. Kemudian dilengkapi dengan display yang mudah untuk dioperasikan oleh user dan dapat menampilkan suhu setingan dan suhu yang telah dicapai oleh alat oven.

Hal-hal yang perlu diperhatikan dalam penggunaan oven yaitu:

1. Demi keamanan, selalu jaga jarak antara bagian atas alat dengan bagian elemen pemanas oven. Setidaknya ada jarak sekitar 1 inchi, serta jangan menggunakan oven ketika pintu dalam keadaan terbuka. Pada proses penggunaan oven, sebaiknya jangan terlalu sering membuka-tutup pintu oven.
2. Dalam perawatannya oven laboratorium sebaiknya dibersihkan setelah digunakan, agar tidak menyimpan debu yang menempel pada bagian-bagian oven. Kemudian hindari penggunaan zat abarsif dalam membersihkan oven, serta hindari mengelap element pemanas pada oven.
3. Memastikan bahwa apabila oven sudah tidak digunakan maka steker listrik alat oven telah dicabut dan dibiarkan hingga suhunya turun atau dingin.
4. Sebaiknya menggunakan kain lap lembut untuk membersihkannya pada bagian dalam atau bagian chamber oven, sedangkan untuk bagian luar Anda bisa menggunakan kain lap basah.
5. Oven laboratorium perlu dirawat agar dapat digunakan secara maksimal, caranya dengan melakukan kalibrasi minimal satu tahun satu kali.

3. Inkubator

Salah satu proses yang paling penting dalam pengujian mikrobiologi adalah inkubasi. Inkubasi dilakukan dengan menggukan inkubator. Inkubasi dalam pengujian mikrobiologi dilakukan untuk melihat apakah adanya pertumbuhan mikroba pada sampel uji. Sebelum melakukan inkubasi, penting untuk mengetahui jenis bakteri yang perlu diuji dan suhu inkubasi yang dibutuhkan untuk menumbuhkan bakteri yang ingin diuji terdapat pada suatu sampel.

Perlu diingat dan diketahui bahwa walaupun umumnya bentuk dan parameter yang dapat diatur sama yaitu suhu, namun inkubator dan oven sangatlah berbeda baik dari segi spesifikasi maupun fungsi. Umumnya inkubator hanya dapat diatur hingga suhu 70°C sedangkan oven dapat mengatur hingga 300°C. Selain itu karena fungsinya inkubator adalah menginkubasi dan menjaga suhu inkubasi sesuai dengan suhu pertumbuhan yang dibutuhkan oleh sampel dan menjaga agar tidak terkontaminasi oleh lingkungan luar, maka inkubator dilengkapi dengan pintu bagian dalam yang biasanya terbuat dari bahan kaca (glass) sehingga memudahkan user dalam memantau pertumbuhan media kultur dan menjaga suhu tetap konstan selama inkubasi berlangsung, sedangkan untuk oven tidak dilengkapi dengan pintu bagian dalam.

4. Waterbath

Selain inkubasi menggunakan inkubator, inkubasi dengan waktu singkat juga dapat dilakukan dengan menggunakan waterbath, selain inkubasi, waterbath juga dapat dilakukan untuk melarutkan media dan pemanasan media uji.

Waterbath menghasilkan panas dengan prinsip panas yang berasal dari aliran listrik yang dihantarkan melalui media air di dalam chamber waterbath menghasilkan panas yang homogen pada media air. Oleh karena itu, user perlu memerhatikan kualitas air yang digunakan pada waterbath. Umumnya air yang digunakan adalah air dengan nilai konduktivitasnya adalah 5 – 10 µS dan nilai pH nya adalah antara 5 dan 7, kurang ataupun lebih dari nilai itu tidak dianjurkan digunakan dalam waterbath karena dapat mengakibatkan korosi pada alat dan kontaminasi pada aplikasi sampel atau bahan yang diinkubasi atau dipanaskan dengan menggunakan waterbath. Kemudian user juga perlu memerhatikan minimum dan maksimum level yang berada pada dinding chamber waterbath ketika airnya diisi ataupun selama proses pemanasan berlangsung, hal ini guna mengoptimalkan aplikasi yang dilakukan dengan menggunakan waterbath. Apabila air yang digunakan pada waterbath tidak sesuai dengan standar spesifikasinya maka dapat menimbulkan korosi dan kontaminasi pada sampel, bahkan dapat menyebakan kerusakan pada alat waterbath yang digunakan.

5. Colony counter

Colony counter berguna untuk untuk menghitung koloni saat pengujian cemaran mikroba pada sampel uji. Kemajuan teknologi menghadirkan colony counter yang modern yang dapat menghitung secara langsung pada alatnya tanpa bantuan hand counter seperti teknologi sebelumnya.

Colony counter yang dibutuhkan dalam pengujian mikrobiologi yaitu colony counter yang tersedia dengan warna dan pencerahan yang dapat dikostumisasi. Colony counter yang digunakan juga sebaiknya memiliki atau tersedia dalam pilihan atau variasi warna yang beragam sehingga memudahkan user untuk memilih dan menyesuaikan dengan media uji ataupun bakteri uji. Colony counter yang digunakan sebaiknya dapat diatur kebutuhan brightness-nya dan memiliki sistem perhitungan yang otomatis dengan impuls perhitungan yang diaktifkan oleh plate count yang sensitif terhadap tekanan sehingga hasil yang terhitung adalah hasil yang akurat. Colony counter yang digunakan sebaiknya dapat menghitung maksimum perhitungannya yang dapat mewakili pengenceran 10^-1, yang artinya dapat menghitung koloni dengan jumlah yang banyak, misalnya 999 koloni. Colony counter yang digunakan sebaiknya memiliki diameter counting plate nya seperti yang umumnya tersedia yaitu 145 mm. Kemudian colony counter yang digunakan sebaiknya memiliki penerangan yang dihasilkan adalah bebas silau dan menggunakan LED dengan daya tinggi. Selain itu penyinaran colony counter yang digunakan sebaiknya bersumber baik dari bawah maupun samping dan tidak akan menghasilkan pemanasan pada cawan petri yang dihitung. Colony counter yang digunakan sebaiknya terbuat dari bahan yang mudah dibersihkan, dan juga dapat menggunakan sisipan pereduksi untuk menggunakan cawan petri yang berdiameter lebih kecil.

6. Mikroskop

Selain melakukan perhitungan koloni, kita juga sebaiknya melakukan pengamatan terhadap mikroba yang terbentuk dari sampel uji untuk memastikan spesies apa yang teridentifikasi dalam sampel uji. Hal ini dapat dilakukan dengan menggunakan mikroskop.

Contoh alat-alat uji mikrobiologi ditunjukkan pada Gambar 1 di bawah ini.

Gambar 1. Alat - Alat Uji Mikrobiologi

 

 

Referensi:

International Organization of Standardization (ISO) 7218 Tahun 2007, dan AOAC official Methods 2005 Chapter 4 Animal Feed.

SNI 2332.7-2015 Cara uji mikrobiologi - Bagian 7: Perhitungan kapang dan khamir pada produk perikanan

SNI 2332.3-2015 Cara uji mikrobiologi - Bagian 3: Penentuan angka lempeng total (ALT) pada produk perikanan

SNI 2897-2008 Metode pengujian cemaran mikrobia dalam daging, telur dan susu serta hasil olahannya

SNI 01-2891-1992 Cara uji makanan dan minuman

SNI 01-2332.2-2006 Cara uji mikrobiologi - Bagian 2: Penentuan Salmonella pada produk perikanan

https://www.allamericancanner.com/Autoclave-Sterilizer.htm      

http://www.hirayama-hmc.co.jp/english/hv2series-med.html