Sumber Aneka Karya Abadi - Your trusted partner for laboratory instrument

Bagaimana caranya mengoptimalkan pertumbuhan sel? Pertumbuhan sel dapat dioptimalkan dengan berbagai cara seperti pemenuhan nutrisi yaitu garam-garam organik, karbohidrat, protein, asam amino, dan vitamin; pengelolaan kondisi lingkungan yaitu suhu, kelembaban (humidity), kebutuhan gas karbondioksida (CO₂) dan/atau gas oksigen (O₂), pengontrolan pH kultur; kondisi steril dan lainnya. Namun berbagai persyaratan tersebut tidak mudah untuk dilakukan di dalam inkubator universal yang umumnya digunakan pada laboratorium. Untuk memaksimalkan pertumbuhan sel, penggunaan inkubator CO₂ lebih tepat digunakan dibandingkan dengan penggunaan inkubator universal. Hal ini merupakan syarat penggunaan alat laboratorium khususnya dalam melakukan kultur sel hewan atau sel mamalia. Inkubator CO₂ merupakan inkubator yang dirancang khusus untuk mensupply kebutuhan pertumbuhan sel seperti, kondisi steril, pemenuhan suhu kultur sel, pemenuhan kelembaban kultur, pemenuhan supply gas CO₂ dan O₂ selama kultur berlangsung. Dan untuk lebih lengkapnya, artikel ini akan mengulas bagaimana proses dan pemenuhan kebutuhan pertumbuhan sel, juga penjelasan perbedaan inkubator CO₂ dengan inkubator universal dan cara pemilihan inkubator CO₂ untuk mengoptimalkan pertumbuhan sel.    

Pertumbuhan Sel

Pertumbuhan sel secara terkontrol dilakukan saat kultur sel. Kultur sel merupakan proses saat sel hidup ditempatkan ke dalam suatu media yang dapat membantu sel tersebut berkembang biak secara in vitro. Kultur sel dapat berupa kultur sel primer maupun cell line. Kultur sel primer merupakan kultur yang dimulai dari sel, jaringan, organ yang diperoleh langsung dari organisme asalnya, sedangkan cell line adalah kultur yang diperoleh dari subkultur pertama dari kultur primer. Kultur sel ini dilakukan guna untuk menumbuhkan sel dan melihat proses pertumbuhan sel yang akan diaplikasikan untuk berbagai tujuan. 

Pertumbuhan sel dilakukan dengan cara mitosis yaitu suatu aktivitas sel untuk membagi nukleus dan sitoplasma menjadi dua, melalui proses yang dimulai dari interfase, profase, metafase, anafase, dan telofase. Untuk dapat mendukung terjadinya proses mitosis, diperlukan persyaratan dari media kultur yang disesuaikan dengan media kehidupan sel atau lingkungan sel secara in vivo atau setidaknya mendekatinya. Selain itu, faktor-faktor yang perlu memengaruhi agar tercapai subtrat yang ideal bagi pertumbuhan sel yang perlu diperhatikan adalah sebagai berikut. 

a. Tonisitas

Tonisitas merupakan factor yang cukup kritis terutama hubungannya dengan proses masuknya bahan-bahan kimia menembus membran sel yang diatur oleh tekanan osmotic dari setiap sisi membran sel. Sel-sel mamalia memiliki tekanan osmotic sebesar 7,6 atmosfer dengan batas toleransi sebesat 10%.

b. Suhu

Sel mamalia mampu bertahan hidup pada rentang suhu yang lebar, suhu optimal agar sel mampu melakukan fungsinya secara efisien pada suhu antara 36-38,5°C. sel akan cepat rusak pada suhu sedikit melebihi suhu optimal, sebaliknya pada penurunan suhu yang gradual sampai mencapai suhu -180°C sel akan bertahan hidup untuk jangka waktu yang sangat Panjang dan dapat dikembangbiakkan Kembali. Sel yang disimpan pada suhu antar 30-33°C proses metabolisme sel tetap terjadi, tetapi sel tersebut tidak dapat membelah, hal ini bertahan sampai beberapa minggu.

c. pH

Tiap jenis sel mempunyai pH optimal pertumbuhan yang berbeda-beda, tetapi secara umum dapat dikatakan bahwa pH optimal bagi pertumbuhan sel adalah 7,2 dan bagi cell line pada pH 7,4 sedangkan pada pH antara 6,8-7,6 sel masih mampu untuk membelah, beberapa cell line fibroblast menunjukkan pertumbuhan terbaiknya pada pH antara 7,4-7,7 dan sel yang mengalami transformasi tumbuh baik pada pH antara 7,0-7,4, tetapi ada juga yang mengatakan bahwa sel epidermal tumbuh baik pada pH 5,5. Sebagai indikator dari pH digunakan fenol merah (phenol red) yang akan berwarna merah pada pH 7,4, berwarna oranye pada pH 7,0 dan berwarna kuning pada pH 6,5 serta merah keunguan pada pH 7,6 dan berwarna ungu pada pH 7,8.

d. Garam Anorganik

Disamping untuk memilihara isotonisitas, garam anorganik kemungkinan juga diperlukan sebagai komponen enzim intraseluler dan system respiratori sel. Ion esensial bagi pertumbuhan sel di antaranya: natrium, kalium, kalsium, magnesium, besi, karbonat, fosfat dan sulfat.

e. Asam Amino

Sel memerlukan asam amino guna sintesis protein dan asam nukleat.

f. Karbohidrat

Digunakan sebagai sumber energi, dan karbohidrat yang banyak digunakan dalam media kultur adalah glukosa, di samping galaktosa dan gula-gula yang lain.

g. Vitamin

Vitamin bertindak sebagai ko-enzim (katalis) dalam metabolisme sel dan vitamin esensial terutama dari golongan vitamin B.

h. Protein

Molekul besar protein dipecah terlebih dahulu oleh enzim ekstraseluler sebelum dimanfaatkan oleh sel.

 

Faktor-faktor lain yang perlu diperhatikan dalam mempersiapkan media pertumbuhan kultur diantaranya sebagai berikut.

1) Fase Gas

Fase gas merupakan hal penting yang perlu diperhatikan dalam mempersiapkan media pertumbuhan kultur. Komposisi utama gas adalah oksigen dan karbondioksida. Kebutuhan oksigen bagi kultur sel sangat bervariasi, terutama apabila dilakukan kultur sel dan kultur organ. Oksigen di atmosfer atau bahkan dengan tekanan oksigen yang rendah sudah cukup untuk memenuhi kebutuhan kultur sel, sebaliknya kultur organ memerlukan fase oksigen sebesar 95% O₂. Diperkirakan pemberian selenium pada media kultur berhubungan dengan tekanan oksigen di samping untuk membantu mengurangi jumlah radikal bebas yang berasal dari oksigen. Kebutuhan oksigen meningkat apabila kultur tanpa protein serum atau lebih dikenal dengan serum-free media. Kedalaman media kultur memengaruhi difusi oksigen untuk mencapai sel, oleh karenanya dianjurkan untuk menggunakan media dengan kedalaman sebesar 0,2-0,5 ml/cm2 pada kultur diam (static culture). Sedangkan untuk peran karbondioksida lebih kompleks dibandingkan dengan oksigen karena adanya kerja yang saling berkaitan antara CO₂ terlarut, pH, dan konsentrasi HCO₃­^-. Hampir semua media menggunakan konsentrasi bikarbonat dan tekanan CO₂ untuk mencapai pH dan osmolalitas yang benar. Pemakaian buffer Good’s seperti: HEPES dan Tricine dalam media kultur diperkirakan untuk mengurangi ketergantungan pemakaian CO₂ sehingga tidak lagi memerlukan CO₂ guna menstabilkan pH. ternyata dugaan tersebut tidak benar karena walaupun telah digunakan buffer HEPES 20 mM dan mampu megontro pada pH fisiologis, ternyata tiadanya CO₂ atmosfer akan mendorong reaksi kimia yang mengeliminasi CO₂ larut dan HCO₃­^- meninggalkan media, akibatnya terjadi hambatan pertumbuhan sel kultur. selain itu, dianjurkan juga untuk menggunakan HCO₃­ dan CO₂ di samping buffer HEPES.

Pemberian natrium piruvat ke dalam media kultur dimaksudkan untuk meningkatkan produksi CO₂ endogen, akibatnya tidak tergantung pada CO₂ eksogen dan HCO₃­- contohnya medium Leibovitz L15 mengandung natrium piruvat dosis tinggi (550 mg/L) tanpa penambahan natrium bikarbonat dan pemberian CO₂. natrium piruvat dapat diganti dengan natrium gliserofosfat yang lebih tahan terhadap autoklaf, tanpa memerlukan CO₂ dan HCO₃­^-. Dalam praktiknya, apabila mengerjakan kultur menggunakan wadah terbuka dengan konsentrasi sel yang rendah harus diinkubasikan di dalam inkubator CO₂. Jika sel yang dikultur konsentrasinya sangat rendah, misalnya pada kloning, mutlak harus dengan penambahan CO₂, walaupun menggunakan wadah yang tertutup rapat. pada kultur sel dengan konsentrasi sel yang tinggi, tidak diperlukan penambahan CO₂ jika menggunakan wadah tertutup rapat, teteapi jika menggunakan wadah terbuka, masih perlu penambahan CO₂. Apabila di dalam kultur memproduksi asam yang banyak dan produksi CO₂ endogen juga tinggi, dianjurkan untuk membuka tutup wadah agar gas CO₂ keluar, tetapi juga dianjurkan untuk menambahkan buffer HEPES guna menstabilkan pH.

2) Buffer (Dapar)

Buffer yang paling banyak digunakan adalah buffer bikarbonat, walaupun kapasitas buffernya rendah pada pH fisiologis, akan tetapi toksisitasnya juga rendah, harganya murah dan dapat digunakan sebagai nutrisi dalam kultur. HEPES mempunyai kapasitas buffer yang sangat kuat pada rentang pH 7,2-7,6 dan banyak digunakan pada konsentrasi 10 atau 20 mM.

 

3) Osmolalitas

Umumnya kultur sel toleran terhadap perubahan tekanan osmotik. Osmolalitas plasma manusia sekitar 290 mOsm/kg dan mencit 310 mOsm/kg sehingga dalam praktik osmolalitas diatur pada 260-320 mOsm/kg yang dapat diterima oleh hampir semua kultur sel. Medium kultur yang sedikit hipotonik sangat baik untuk kultur yang dilakukan dalam cawan petri guna mengkompensasi terjadinya penguapan selama inkubasi.

4) Tekanan Permukaan dan Busa

 Tekanan permukaan dari suatu medium kultur diperlukan untuk mendukung perlekatan dari kultur primer pada permukaan wadah. Pada kultur suspensi yang gas CO₂ ditambahkan akan menyebabkan terjadinya busa dari serum yang digunakan, dianjurkan untuk menambahkan silicone anti-foam ke dalam medium. terjadinya busa menyebabkan peningkatan denaturasi protein dan risiko terjadinya kontaminasi.

5) Viskositas

Viskositas suatu medium tidak banyak memengaruhi pertumbuhan sel, akan tetapi kalau pertumbuhan sel dalam bentuk suspensi (suspension culture), viskositas diperlukan agar sel terdispersi merata dan mengurangi kerusakan sel karena benturan antara sel. untuk meningkatkan viskositas medium pada kultur suspensi diperlukan penambahan PVP (polyvinil pyrolidone) atau CMC (carboxy methyl cellulose).

 

Kultur Sel Primer

Bahan Kultur dapat berasal dari jaringan normal, embrionik dan jaringan malignan. Pertama-tama jaringan dipisahkan dan dikumpulkan secara aseptik. Secara umum metode untuk pemisahan sel untuk kultur adalah secara mekanik, enzimatis dan menggunakan chelating agents. Begitu jaringan teragregasi, sel segera dikumpulkan dan dihitung jumlah sel yang hidup dan dibuat suspensi dan dikultur selama 24 jam. Adapun langkah-langkah Kultur Sel Primer akan dijabarkan lebih lanjut di bawah ini.

1. Isolasi Sel untuk Kultur

Pengerjaan isolasi sel dilakukan di dalam kabinet laminar flow. Bahan embrio dipotong dan bagian tubuh embrio diambil dan dipindahkan ke dalam cawan petri yang baru kemudian dibilas beberapa kali dengan larutan BSS. Selanjutnya embrio dipotong-potong sampai menjadi ukuran kira-kira sebesar 1 mm3 dengan menggunakan scalpel steril. Kemudian potongan embrio dipindahkan ke dalam tabung sentrifus dengan pipet steril, dan disuspensikan dengan larutan BSS dan dibiarkan mengendap dan dilakukan secara berulang sebanyak 3-4 kali. setelah itu, potongan embrio dipindahkan ke dalam erlenmeyer steril dan dimasukkan larutan tripsin 0,25% dalam 1mM EDTA, lalu diputar dengan menggunakan stirrer dan magnetic bar pada 200 rpm selama 30 menit pada suhu 36,5°C (dapat juga dilakukan inkubasi dingin dengan merendam potongan embrio di dalam larutan tripsin selama 6-18 jam pada suhu 4°C guna mengurangi kerusakan sel karena aktivitas enzim). Potongan embrio dibiarkan mengendap, bagian supernatan dipipet dan dimasukkan ke dalam tabung sentrifus, dan diputar pada kecepatan 500 rpm selama 5 menit. Selanjutnya endapan sel disuspensikan dengan media pertumbuhan yang mengandung 10% Foetal Bovine Serum (FBS) dan disimpan pada suhu dingin. Sedangkan sisa potongan embrio ditambahkan larutan tripsin yang baru dan dikerjakan sekali lagi seperti cara sebelumnya. Suspensi sel yang terkumpul dilakukan perhitungan jumlah sel menggunakan hemositometer dan pengecatan trypan blue. Pada suspensi sel yang dihitung hanyalah sel-sel yang hidup (viable cells) yang ditandai dengan tidak diabsorpsinya warna biru dari trypan blue.   

2. Cara mengkultur Sel

Suspensi sel yang telah memiliki kepadatan sel sebanyak 2 x 10⁵ sel/ml dipindahkan ke dalam botol/tabung kultur dan diinkubasikan pada suhu 37°C di dalam inkubator. Selama inkubasi, dilakukan pengamatan perubahan warna pada media kultur, apabila warna media berubah menjadi warna kuning artinya terjadi penurunan pH yang diakibatkan oleh pertumbuhan sel atau dapat juga terjadinya kontaminasi mikroba. Apabila terjadinya kontaminasi, maka kultur yang terkontaminasi dapat dibuang, dan kultur yang tidak terkontaminasi tetapi terjadinya perubahan warna dapat diganti dengan media yang baru. Penggantian media baru pada tahap awal inkubasi kultur primer umumnya dilakukan pada interval waktu 2-4 jam sekali. Kultur yang baik, setelah diinkubasi selama 12-24 jam akan dicapai 100% confluent, artinya seluruh permukaan bawah botol kultur telah dipenuhi oleh pertumbuhan sel monolayer. Ada 4 faktor yang mengindikasikan diperlukannya penggantian media kultur yaitu penurunan pH, konsentrasi sel, tipe sel dan morfologi sel.     

 

Cell line

Subkultur (passage, transferred) pertama dari suatu kultur primer akan menghasilkan cell line. Istilah cell line menunjukkan adanya jalur sel (cell lineage) baik dalam bentuk fenotip yang sama maupun berbeda, dan apabila salah satu jalur sel tersebut diseleksi, misalnya dengan cara kloning, pemisahan secara fisik atau dengan cara teknik pemisahan yang lain akan diperoleh sel dengan sifat spesifik tertentu yang dikenal dengan istilah "the bulk of the cells" sel yang demikian dinamakn cell strain, jika cell strain dapat disubkultur sampai jumlah yang sangat besar, maka dinamakan continuous cell strain.

Untuk melakukan subkultur, umumnya sel dilepas dari dinding wadah dengan cara tripsinasi. Beberapa jenis sel tidak dapat dikelupas menggunakan tripsin, untuk itu perlu mencari enzim yang sesuai, misalnya menggunakan pronase, dispase, atau kolagenase. Subkultur dilakukan di dalam kabinet laminar flow, medium kultur dituang dan dibuang. lapisan sel dicuci dengan larutan PBSA untuk menghilangkan sisa-sisa serum, supaya tidak mengganggu kerja tripsin. Kemudian ditambahkan larutan tripsin (3ml/25 cm²), digoyang-goyang sampai semua larutan tripsin membasahi lapisan sel, didiamkan pada suhu kamar selama 15-30 detik, kemudian larutan tripsin dituang. Diinkubasi beberapa menit sampai sel terkelupas dan dapat diamati dengan mata telanjang dan segera ditambahkan medium kultur yang mengandung serum agar aktivitas tripsin terhenti, dengan menggunakan pipet sel didispersi menjadi suspensi sel dalam media kultur. Kemudian dihitung jumlah sel menggunakan hemositometer atau coulter counter, kemudian dibuat perkiraan untuk dijadikan berapa botol subkultur yang akan dikerjakan. Setelah itu dibagi-bagikan ke dalam botol kultur dan ditambahkan medium kultur yang baru dalam jumlah yang sesuai dan dimasukkan ke dalam inkubator. Setelah satu jam inkubasi, dilakukan pemeriksaan perubahan pH yang terjadi. Jika pH medium naik, pengaliran gas CO₂ dilakukan ke dalam inkubator CO₂ dengan 5% gas CO₂.

 

Perbedaan Inkubator CO2 dan Inkubator Universal

Apakah inkubator CO₂ bisa digantikan dengan penggunaan inkubator universal? Untuk sampel sel hewan atau sel mamalia khususnya, kebutuhannya berbeda dengan sel bakteri atau mikroorganisme lainnya, sehingga inkubasi untuk pertumbuhan sel hewan atau sel mamalia khususnya tidak dapat dilakukan dengan penggunaan inkubator universal. Pertumbuhan sel hewan dan sel mamalia khususnya membutuhkan supply gas CO2 dan/atau O2 dan hal ini tidak tersedia pada inkubator universal. Dan ada juga beberapa perbedaan lainnya yang dapat dilihat pada Tabel 1 di bawah ini:

No.	Deskripsi	Inkubator CO2	Inkubator Universal
1.	Range temperature (°C)	+18°C hingga +50°C	20 Hingga +80°C
2.	Akurasi temperature	0,1°C	0,1°C
3.	Range CO2 (% CO2)	0% hingga 20% CO2	Tidak tersedia
4.	Range O2 (% O2)	1% hingga 20% O2	Tidak tersedia
5.	Range kelembaban (% rh)	40% hingga 97% rh	Tidak tersedia
6.	Inner Glass door	Tersedia	Tersedia
7.	Program sterilisasi	Tersedia	Tidak tersedia untuk semua, hanya tersedia untuk model twin-display

 

Pemilihan Inkubator CO₂ untuk Mengoptimalisasi Pertumbuhan Sel

Inkubator CO₂ digunakan pada kultur sel untuk mengontrol pertumbuhan sel, hal ini guna untuk mengkondisikan keadaan yang sesuai dengan keadaan sebenarnya. CO₂ juga sangat penting dibutuhkan dalam kultur sel berguna untuk menjaga pH medium kultur sehingga tidak mengalami kerusakan kultur. Adapun hal-hal yang perlu diperhatikan dalam memilih inkubator CO₂ yaitu:

1. Memilih inkubator CO₂ yang tersedia dalam berbagai ukuran sehingga memudahkan analis memilih yang sesuai dengan kebutuhan di laboratorium. Misalnya tersedia dalam volume 56 L, 107 L, 156 L, dan 241 L. 
2. Inkubator CO₂ yang dipilih sebaiknya mudah untuk digunakan atau dioperasikan oleh analis dan memiliki display yang mudah dimengerti dan dibaca untuk melakukan pengontrolan.
3. Inkubator CO₂ yang dipilih sebaiknya berbahan stainless steel yang berkualitas dan mudah dibersihkan.
4. Inkubator CO₂ yang dipilih sebaiknya memiliki double door agar menghindari kontak langsung media kultur dengan lingkungan luar ketika dipantau.
5. Inkubator yang dipilih harus dapat meng-supply gas CO₂ dan O₂ yang dapat disalurkan langsung ke dalam inkubator.
6. Inkubator CO₂ yang dipilih sebaiknya memiliki CO₂ dan O₂ kontrol yang memudahkan user dalam memantau.
7. Inkubator CO₂ yang dipilih sebaiknya memiliki range kontrol supply CO₂ dan O₂ yang luas dan dapat diatur sesuai dengan kebutuhan user, misalnya 0-20% CO₂.
8. Inkubator CO₂ yang dipilih sebaiknya memiliki range suhu yang sesuai dengan kebutuhan kultur sel, misalnya 18-50°C.
9. Inkubator CO₂ yang dipilih sebaiknya memiliki range humidity yang dapat diatur sesuai dengan kebutuhan, misalnya 40-97% rh. Ataupun jika parameter humidity tidak dibutuhkan, maka parameter ini dapat dinonaktifkan pada inkubator.
10. Inkubator CO₂ yang dipilih sebaiknya memiliki alarm visual dan akustik dalam mengontrol supply CO₂ dan O₂ juga humidity apabila melebihi pengaturan yang diinginkan.
11. Inkubator CO₂ yang dipilih sebaiknya memiliki program sterilisasi pada inkubator. Sehingga memudahkan user dalam melakukan sterilisasi inkubator. misalnya terdapat program sterilisasi pada suhu 180°C selama 2 jam (60 menit).

Adapun contoh tampilan inkubator CO₂ yang sebaiknya digunakan dalam melakukan kultur sel agar dapat mengoptimalkan pertumbuhan sel dapat dilihat pada Gambar 1 di bawah ini.

Gambar 1. Inkubator CO₂